REZISTENTA MICROORGANISMELOR LA AGENTII ANTIMICROBIENI

Rezistența microorganismelor  la agenții antimicrobieni – o problemă de actualitate în sectorul zootehnic

Chiar din anii 2000, Uniunea Europeană a interzis utilizarea antibioticelor ca promotori de creștere (Parlamentul European și Consiliul European, 2003). Cu toate acestea, antibioticele au fost utilizate în continuare în scopul contracarării episoadelor endemice sau recurente de boală, fapt ce prezintă un risc major privind transferul bacteriilor rezistente la agenții antimicrobieni (sau al elementelor ce codifică genetic această caracteristică) de la animal la om, prin alimente și nu numai (Davies și Wales, 2019). 
O mare parte dintre antibioticele utilizate astăzi a fost dezvoltată având la bază chiar compușii obținuți de la microorganisme, aceștia având rolul de a distruge competiția de ordin microbian. De exemplu, penicilina a fost derivată dintr-un compus chimic produs de speciile de mucegaiuri Penicillium (O’Bryan și col., 2018). 
Speciile bacteriene ce prezintă rezistență la antibiotice și care totodată constituie un risc în zootehnie sunt microorganisme ce provoacă zoonoze, fiind transmisibile mai ales prin alimente. Considerate a fi cele mai riscante sunt: Salmonella enterica, Campylobacter spp. și Staphylococcus aureus (rezistent la meticilină, denumit astfel MRSA). Acestea joacă un rol activ în apariția zoonozelor, însă sunt responsabile și de transmiterea elementelor genetice (plasmide) ce codifică rezistența la antibiotice (Davies și Wales, 2019). 
Speciile bacteriene dețin gene ce codifică rezis­tența, în absența unor factori ce pot exercita presiune antropogenă de selecție (Allen, 2014). 

1. Principalele potențiale cauze ale apariției rezistenței la antibiotice
Cauza principală a antibiorezistenţei, identi­ficată inițial, este utilizarea antibioticelor cu scop curativ, la nivel de fermă. Mecanismul de declanșare a acestui tip de rezistență este bazat pe:

• Apariția unei mutații ce afectează sit-urile țintă pentru antibiotice;
• Creșterea fenomenului de expresie a genelor ce codifică rezistența;
• Selecția pentru multiplicare pe orizontală a genelor de rezistență (Davies și Wales, 2019).

Gillings (2016) susține că a doua cauză, la nivel de fermă, este utilizarea antibioticelor,  fapt ce determină creşterea frecvenței transferului conjugat dintre bacterii a materialului genetic responsabil pentru apariția rezistenței. Cu toate acestea, mecanismul unui astfel de transfer este încă insuficient studiat la acest moment. 
În 2011, EFSA (2011b) a publicat un raport în care menționează faptul că există inclusiv posibilitatea transferului vertical, de la o rasă importată, purtătoare a genelor responsabile de rezistența la antibiotice, la o alta. Mecanismul de transfer vertical este însoțit de recircularea locală și de selecție. 
Bennet (2008) sugerează faptul că genele de rezistență sunt transmise de la o bacterie la alta, prin intermediul unui transfer de gene pe orizontală. Aceste gene sunt transmise prin: transducție (bacteriofagi și integroni, ca mijloc de transport), conjugare (prin plasmide și transpozoni conjuganți) sau prin transformare (prin încorporare de ADN cromozomial din plasmidele cuprinse într-un cromozom). Ulterior, genele transferate sunt încorporate într-un cromozom prin recombinare sau transpoziție, fapt ce poate determina modificări ale secvenței genetice. 

2. Factori de risc al rezistenței la antibiotice pentru activitatea desfășurată în unitățile avicole
Prezența microorganismelor enterice cu potențial zoonotic (Salmonella și Campylobacter) în unitățile de creștere a păsărilor a sporit atenția specialiștilor prin creșterea incidenței rezistenței la antibiotice, o rezistență vizibilă inclusiv în cazul microorganismelor comensale (E. coli). Acestea din urmă prezintă capacitatea de a fi purtătoare de elemente mobile de rezistență, precum plasmidele, fapt ce poate determina transferul rezistenței la antibiotice către ale specii bacteriene (Wales și Davies, 2019). 
Nivelul crescut de rezistență la antibiotice, în cazul speciilor de Salmonella (Hur și col., 2012) este atribuită mai multor mecanisme: producția de enzime cu rol de inactivare a antibioticelor, reducerea permeabilității celulelor bacteriene, activarea unor pompe de flux și modificarea target-ului celular pentru substanțe necunoscute sau care nu au fost deja aprobate. 
Într-un studiu din 2004, Mayrhofer și col. au analizat cu atenție rezistența la acțiunea antibioticelor a cinci specii separate de microorganisme de interes din punct de vedere al siguranței alimentelor, izolate din carnea provenită de la trei specii: porc, vită și pui.

Aceștia au descoperit următoarele: 

• Rezistența la antibiotice a speciilor de Campylobacter, Salmonella și E. coli (patogenic) a fost extrem de crescută și ratele de rezistență au fost similare;
• Salmonella și E. coli au dezvoltat rezistență la mai multe clase de antibiotice – de exemplu, la E. coli și Salmonella, s-a observat o asociere a rezistenței la acid nalidixic cu cea la ciprofloxacin;
• La speciile de Campylobacter și Salmonella, rezistența la quinolone a atins un nivel de 40%, în comparație cu E. coli. În acest ultim caz, rezistența s-a observat la carnea provenită de la pui;
• Toate speciile studiate au prezentat rezistență la tetraciclină, acest fapt sugerând conexiunea dintre antibioticele utilizate frecvent în tratamentul animalelor de interes economic și rezistența microorganismelor la aceleași clase de antibiotice.

S-a constatat că rezistența la antibiotice poate fi asociată cu câțiva factori externi de biosecuritate, precum proximitatea unităților de creștere a sui­nelor, sau personalul ce lucrează concomitent cu alte specii de interes economic. Conform Wales și Davies (2019), o serie de măsuri, precum separarea activităților desfășurate în cadrul efectivelor (utilizarea de echipament separat pentru fiecare, de exemplu), pare a prezenta o eficiență acceptabilă.
Un alt factor de risc poate fi considerat prezența păsărilor sălbatice în proximitatea unității de creș­tere. Aceiași autori menționează rolul potențial protector al următorilor factori: utilizarea unei măști de către lucrători, suprafețele cu care păsările intră în contact au fost curățate temeinic de praf și unitățile de furajare au fost igienizate și dezinfectate. 
Înlocuirea antibioticelor cu alte sub­stanțe de tipul probioticelor, prebioticelor, simbioticelor sau acizilor organici poate reprezenta o variantă potrivită, alături de măsurile de biosecuritate. Aceasta reprezintă o soluție agreată nu numai de specialiștii din industria avicolă, ci și de consumatori, ca alternativă la antibiotice. În 2003, ulterior interzicerii utilizării antibioticelor ca promotori de creștere, Edens sugera faptul că industria avicolă (ca parte a sectorului zootehnic) ar putea fi impactată economic prin introducerea probioticelor. Însă, același autor indică și faptul că utilizarea produselor alternative, precum probioticele, este benefică pe termen lung. Nu toate produsele din această categorie funcționează în același mod, astfel influențând diferit statusul fiziologic la nivel intestinal. 
Probioticele au demonstrat eficacitatea prin inhibarea dezvoltării speciilor bacteriene patogene atât in vitro cât și in vivo, prin diferite mecanisme: 
1) Menținerea unei microflore intestinale prin ex­cludere competitivă și prin antagonism; 
2) Alterarea metabolismului prin creșterea activității enzimelor digestive și scăderea eficienței activității enzimelor bacteriene și producției de amoniac; 
3) Îmbunătățirea ingestiei de furaj și a digestiei; 
4) Stimularea sistemului imunitar (Lutful Kabir, 2009). 
Prebioticele utilizate predominant sunt pro­dusele pe bază de fructooligozaharide (inulină, oligofructoză, FOS - abreviere a termenului „Fructooligosaccharide”). Acestea au principalul rol de îmbogățire selectivă a populațiilor bacteriene benefice. Pe de altă parte, mannanoligozaharidele (MOS), utilizate, de asemenea, cu succes, în același mod, nu funcționează prin același mecanism. Acestea din urmă acționează prin legarea și îndepărtarea agenților patogeni de la nivel intestinal, stimulând concomitent sistemul imunitar (Patterson și Burkholder, 2003). 
Bacteriofagii au fost, de asemenea, incluși în lista produselor alternative pentru prevenirea și abordarea infecțiilor bacteriene la păsări, primul produs comercial fiind lansat în 1930. 
Pentru potențialele aplicații din industria avicolă, s-au realizat studii pentru următoarele specii bacteriene: Salmonella, Campylobacter, E. coli și Clostridium perfringens (Hume, 2011). 
În privința uleiurilor esențiale, acestea sunt 
cunoscute pentru stimularea secrețiilor enzi­melor digestive, stimularea circulației sanguine, exercitarea proprietăților antioxidante, reducerea încărcăturii de bacterii patogene din organism și creșterea sistemului imunitar (Brenes și Roura, 2010).
Extractele din plante au demonstrat proprietăți antimicrobiene, anticoccidiene, fungicide și anti­oxidante. Astfel, carvacrol, thymol și cinnamaldehida au produs inhibarea dezvoltării bacteriilor Gram negative, precum E. coli și S. enterica serovar typhimurium (Applegate și col., 2010). 
Cu toate acestea, există și un dezavantaj, mai precis faptul că lactobacilii ar putea, de asemenea, prezenta sensibilitate la efectele antimicrobiene ale uleiurilor esențiale. 

3. Posibilități de ordin tehnic pentru studierea rezistenței speciilor bacteriene la antibiotice
Analiza metagenomică a întregului ADN din cadrul unei comunități bacteriene poate reprezenta o metodă eficientă pentru evaluarea genelor ce codifică acest tip de rezistență (Allen, 2014). Această metodă poate fi folosită practic pentru descoperirea unor aspecte neprevăzute ale ecologiei genelor de rezistență la antibiotice. De asemenea, adnotarea genelor de rezistență la antibiotice a fost mult îmbunătățită, mai întâi prin ARDB (Antibiotice Resistance Gene Database) și ulterior prin CARD (Comprehensive Antibiotice Resistance Database). 
În 2005, Perreten și col. au dezvoltat un test pentru detecția a 90 de gene ce codifică rezistența bacteriilor Gram pozitive la antibiotice, prin metoda hibridizării. Fiecare genă ce codifică rezistența la antibiotice este reprezentată prin două oligonucleotide specifice selectate din secvențe ale familiilor genetice, cu excepția a nouă gene pentru care nu s-au putut dezvolta oligonucleotide. În acest multitest, a fost identificat un număr de 137 de oligonucleotide, fiecare test din serie fiind supus unei hibridizări cu 36 de tulpini purtătoare de gene ce codifică rezistența la antibiotice. Acestea au permis testarea sensibilității și specificității pentru 125 de oligonucleotide. Utilizând acest test, Perreten și col. (2005) au realizat detecția a 12 gene de rezistență la antibiotice pentru specia Staphylococcus haemolyticus și 6 pentru Clostridium pefringens. Testul conceput în cadrul acestui studiu, denumit ArrayTube, poate fi astfel utilizat ca metodă rapidă de detecție a genelor de rezistență pentru speciile bacteriene Gram pozitive. 
O altă metodă de identificare a genelor responsabile pentru codificarea rezistenței la antibiotice a speciilor bacteriene a fost propusă în 2014 de Gupta și col., fiind denumită ARG-ANNOT (Antibiotice Resistance Gene-ANNOTation). Aceasta reprezintă un sistem bioinformatic creat pentru identificarea genelor ce codifică rezistența la antibiotice, atât cele existente și cât și cele nedescoperite încă, din genomul bacterian. Utilizând baza de date GenBank a NCBI (National Center for Biotechnology Information - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), autorii au construit o nouă bază de date ce conține 1689 de gene de rezistență. Programul ce realizează identificarea acestor gene, pe baza materialelor analizate (genom specie bacteriană), este denumit BLAST. 

Bibliografie
Allen H.K. (2014). Antibiotic resistance gene discovery in food-producing animals, Current Opinion in Microbiology, 19: 25-29. 
Applegate T.J., Klose V., Steiner T., Ganner A., Schatzmayr G. (2010). Probiotics and phytogenics for poultry: Myth or reality? The Journal of Applied Poultry Research, 19 (2): 194-210. 
Bennet P.M. (2008). Plasmid encoded antibiotic resistance: acquisition and transfer of antibiotice resistance genes in bacteria, British Journal of Pharmacology, 153, 347-357. 
Brenes A., Roura E. (2010). Essential oils in poultry nutrition: main effects and modes of action, Animal Feed Science and Technology, 158 (1-2): 1-14. 
Davies R., Wales A. (2019). Antimicrobial Resistance on Farms: A Review Including Biosecurity and the Potential Role of Disinfectants in Resistance Selection, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 18 (3): 753-774. 
Edens F.W. (2003). An alternative for antibiotic use in poultry: probiotics, Brazilian Journal of Poultry Science, 5 (2). 
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=s1516-635x2003000200001&script=sci_arttext
EFSA (2011b). Scientific opinion on the public health risks of bacterial strains producing extended-spectrum β-lactamases and/or AmpC β-lactamases in food and food producing animals: ESBL/AmpC in food-producing animals and foods, EFSA Journal, 9 (8), 2322. 
Gillings, M.R. (2016). Lateral gene transfer, bacterial genome evolution, and the Anthropocene. Annals of the New York Academy of Sciences, 1389 (1), 20-36. 
Gupta S.K., Padmanabhan B.R., Diene S.M., Lopez-Rojas R., Kempf M., Landraud L., ROlain J.-M. (2014). ARG-ANNOT, a new bioinformatic tool to discover antibiotic resistance genes in bacterial genomes, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 58 (1): 212-22-. 
Hume M.E. (2011). Historic perspective: prebiotics, probiotics and other alternatives to antibiotics, Poultry Science, 90 (11): 2662-2669.
Hur J., Jawale C., Hwa Lee J. (2012). Antimicrobial resistance of Salmonella isolated from food animals: a review, Food Research International, 45: 810-830. 
Lutful Kabir S.M. (2009). The role of probiotics in the poultry industry, International Journal of Molecular Sciences, 10: 3631-3546. 
Mayrhofer S., Paulsen P., Smulders F.J.M., Hilbert F. (2004). Antimicrobial resistance profile of five major food-borne pathogens isolated from beef, pork and poultry, International Journal of Food Microbiology, 97, 23-29. 
O’Bryan C.A., Crandall P.G., Ricke S.C. (2018). Chapter 6 – Antimicrobial Resistance to Foodborne Pathogens, in: Food and Feed Safety Systems and Analysis, p. 99-115. 
Parlamentul European și Consiliul European, 2003 – Regulamentul CE nr. 1831/2003 al Parlamentului European și al Consiliului din 22 Septembrie 2003 cu privire la utilizarea aditivilor în hrana animalelor. Official Journal of the European Union, 46, 29-43. 
Patterson J.A., Burkholder K.M. (2003). Application of prebiotics and probiotics in poultry production, Poultry Science, 82 (4): 627-631. 
Perreten V., Vorlet-Fawer L., Slickers P., Ehricht R., Kuhnert P., Frey J. (2005). Microarray-Based Detection of 90 Antibiotic Resistance Genes of Gram-positive Bacteria, Journal of Clinical Microbiology, 43 (5): 2291-2302. 
Wales A., Davies R. (2019). Antimicrobial drug resistance in Salmonella and related organisms in poultry – what do we know about risk factors? Proceedings of Turkey Science and Production Conference, March 2019, p. 3-7.